油菜籽硫甙的測(cè)定－光度法

1．范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采用光度法測(cè)定油菜籽中硫甙含量的方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于油菜常規(guī)育種、雜交三系、兩系育種、輻射育種以及生物技術(shù)選育中芥酸硫甙含量檢測(cè)以及油菜種子和商品油菜籽收購(gòu)過(guò)程中硫甙含量快速測(cè)定。

2．原理

利用酶的專一性，油菜籽中硫甙與特異性酶（Gln MEN）反應(yīng)后，生成產(chǎn)物與專用顯色劑（Chrom G）反應(yīng)形成有特征吸收峰的有色產(chǎn)物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定硫甙含量。

3．試劑

除特殊標(biāo)明外，所有試劑均為分析純（A.R）,水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

3.1 硫甙測(cè)定A液。

3.2 硫甙測(cè)定B液。

3.3 硫甙測(cè)試板。

4．儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器及下列各項(xiàng)。

4.1 微型粉碎機(jī)。

4.2 電子天平（量程 0-200 g，最小讀數(shù)100 mg）。

4.3 40-200 μL微量移液器。

4.4 1000 μL微量移液器。

4.5 脫脂棉。

4.6 石英比色杯（18 mm×18 mm）。

4.7 芥酸硫甙速測(cè)儀。

5．取樣

按照GB5491扦取油菜籽樣品，取樣時(shí)，應(yīng)清除樣品外來(lái)雜質(zhì)。

6．操作步驟

6.1 試樣的制備

按照GB5491對(duì)扦取的油菜籽樣品進(jìn)行縮分，取其中一份樣品約10 g在微型粉碎機(jī)中粉碎20秒，將粉碎物混勻，再粉碎5秒（亦可用研缽將樣品研碎過(guò)40目篩）。

6.2 稱樣

準(zhǔn)確稱取0.50 g（精確到100 mg）樣品于5 mL具塞試管中。

6.3 提取

用移液管加入3 mL硫甙測(cè)定A液，蓋緊蓋子，用力搖動(dòng)試管，混勻后反應(yīng)8分鐘(中途再混勻兩次)。

6.4 過(guò)濾

用玻璃棒將蓬松、紋路一致、適量的脫脂棉緩緩塞入試管中，當(dāng)脫脂棉接觸液面后，將試管平放桌面上，讓脫脂棉自動(dòng)吸液，吸滿后，豎起離心管再用玻璃棒將脫脂棉往下輕壓，至濾出清液為止，也可采用離心或?yàn)V紙過(guò)濾得到上清液。

6.5 酶－顯色反應(yīng)

取出密封保存的硫甙測(cè)試板（可分條取用，其它密封，避光保存），用微量移液器取50 μL 上清液于測(cè)試板孔中，同時(shí)選一孔加入50 μL硫甙測(cè)定B液作為空白；酶解反應(yīng)8min，中途用吸耳機(jī)吹氣兩次，使酶解反應(yīng)均勻一致。

6.6 顯色液稀釋

用微量移液器取150 μL硫甙測(cè)定B液，分別加入空白孔及樣品孔中，繼續(xù)反應(yīng)2min，中途吹氣一次，使體系均勻穩(wěn)定。

6.7 測(cè)定

在芥酸硫甙速測(cè)儀上，以試劑空白作零點(diǎn)，選擇“儀器校準(zhǔn)”，記憶零點(diǎn)值，然后選擇“樣品測(cè)量”，即可進(jìn)行樣品測(cè)試分析，讀數(shù)值即為每克油菜餅粕中所含硫甙總量的微摩爾數(shù)（μmol／g）。

7．精密度和允許誤差

重復(fù)測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6％；兩次平行測(cè)定結(jié)果芥酸相差小于0.8%；兩次平行測(cè)定結(jié)果硫甙相差小于4.0μmol/g。測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示。